Ritarikunnan uusi tukikohta luotiin keisari Kaarle V:n ritarikunnalle myöntämällä 23. maaliskuuta 1530 päivätyllä maanvuokrasopimuksella, johon kuuluivat Gozon, Cominon, Cominotton ja Filflan saaret sekä Tripolin kaupunki Pohjois-Afrikassa. Ritarien vuokrasopimuksen kaksi kummallista ehtoa olivat, että ritarikunnan oli pysyttävä puolueettomana kaikissa kristittyjen kansojen välisissä sodissa ja että ritarikunnan vuotuinen vuokramaksu oli yhden haukan maksaminen vuosittain Kaarle V:lle - tästä juontaa juurensa termi: Maltan haukka. Ritarit, suurmestari Fra. Phillippe de Villiers de l'Isle Adamin johdolla, ottivat Maltan haltuunsa, ja seuraavien 268 vuoden aikana heidän voimansa ja varallisuutensa kasvoivat, ja he muuttivat Maltan kukoistavaksi saareksi. Ritarikunnan puolustus selviytyi monista ottomaanien hyökkäyksistä, muun muassa vuonna 1565 käydystä kolmen kuukauden mittaisesta taistelusta, joka tunnetaan nimellä "Maltan suuri piiritys".

Ritarikunnasta tuli yksi Euroopan suurvalloista, sillä sen mahtava laivasto risteili ja suojeli Välimerta uudelta vitsaukselta, Barbarian merirosvoilta. Sairaalat olivat ensimmäisiä Maltalle rakennettuja hankkeita, mutta ritarit rakensivat myös linnoituksia, vartiotorneja ja kirkkoja, joista monet ovat yhä pystyssä lähes 500 vuotta myöhemmin. Pääsairaalaan mahtui 500 potilasta, ja sitä pidettiin yhtenä maailman hienoimmista. Sen lääketieteelliseen tiedekuntaan kuuluivat anatomia, kirurgia ja farmasia. Erityinen erikoisala oli silmälääketiede. Juuri Maltan sairaalassa perustettiin virallisesti lääketieteen erikoistuminen ja sertifiointi. Pääkaupunki Valletta saavutti suuren suosion taide- ja kulttuurikeskuksena. Arkkitehtuuri ja rakentaminen kukoistivat. Linnoituksissa, julkisissa rakennuksissa, puutarhoissa ja kirkoissa (muun muassa vuonna 1577 valmistuneessa Pyhän Johannes Kastajan kirkossa, johon monet ritarit on nyt haudattu) on Caravaggion, Mattia Pretin ja muiden teoksia.

Maltan suuri piiritys

Maltan suuri piiritys vuonna 1565 oli merkittävä voitto, kun ritarit ja heidän sotilaansa voittivat valtavat vihollisjoukot sekä maalla että merellä. Piiritys oli käsittämättömän julma yhteenotto ja yksi kaikkien aikojen verisimmistä taisteluista. Se oli myös tapahtuma, joka määritteli historian kulun ja jossa kristinuskon säilyminen oli vaakalaudalla. Jos strategisesti elintärkeä Malta kaatuisi, muslimien Ottomaanien valtakunta hallitsisi pian koko Välimeren aluetta. Jopa Rooma oli vaarassa. Sulttaani Suleiman hallitsi maailman suurinta taisteluvoimaa, ja hänellä oli 200 laivan armada ja 40 000 sotilaan armeija, kun hän aloitti taistelunsa ritareita vastaan. Hän aikoi pyyhkiä Johanneksen ritarit ja Maltan kartalta. Toukokuun 18. päivänä turkkilainen tykistö pääsi valloilleen, ja sitä seurasi aalto toisensa jälkeen huutava, sapeleita heiluttava ratsuväki. Suurmestari Jean Parisot de la Vallette vannoi, että linnoitusta ei valloitettaisi niin kauan kuin Maltalla olisi edes yksi kristitty. Kuusisataa ritaria, muutama tuhat paikallista talonpoikaa ja palkkasoturia sekä muutama tuhat maltalaista irrallista sotilasta - yhteensä 6 000-9 000 miestä - kesti ja lopulta kukisti paljon suuremman, ylivoimaisen vihollisjoukon. Kun yli 30 000 turkkilaista oli saanut surmansa, ottomaanit vetäytyivät ja ritarit juhlivat voittoa 8. syyskuuta. Tästä uroteosta on tullut olennainen osa maailman sotahistoriaa, sillä se on osa sankaritarinaa Johanneksen ritarien rohkeudesta ja sotilaallisesta ylivoimasta. Seuraavien kolmen vuoden aikana suurmestari La Vallette suunnitteli ja rakensi Vallettan suuren satama- ja linnoituskaupungin. Hän kuoli vuonna 1568 eikä koskaan nähnyt suurenmoisen hankkeensa valmistuvan. Hänet on haudattu kaupunkiin, joka kantaa hänen nimeään.

Vuonna 1775 ritarikunta sulautti itseensä muinaisen Viennen Pyhän Antoniuksen hospitaaliritarikunnan, jonka alueet sijaitsivat pääasiassa Ranskassa. Lisääntyneen varallisuutensa ansiosta ritarikunta oli entistä näkyvämpi - ja halutumpi - muille, muun muassa Napoleon Bonapartelle. Hallittuaan Maltan saaria yli 250 vuotta ritarikunta joutui vuonna 1798 Napoleon Bonaparten joukkojen hyökkäyksen kohteeksi, kun tämä oli matkalla Egyptin sotaretkelle. Petoksen ja petoksen avulla Napoleon valloitti linnoituksen, ryösti Maltan ja syrjäytti ritarit saaren hallitsijoista.

Silloinen suurmestari - Ferdinand von Hompesch zu Bolheim - lähti vain muutaman ritarin kanssa [1], Triesteen Itävallassa (nykyisessä Italiassa) 18. kesäkuuta 1798, mikä päätti ritarikunnan ja Maltan saaren välisen yhteyden tuona aikana.

Vähemmän rohkeat jäsenet palasivat kotimaahansa, liittyivät olemassa oleviin itsenäisiin instituutioihin tai muodostivat uusia ryhmiä, ja seitsemän Italian Languen ritarikuntaa lähti Sisiliaan paavin suojeluksessa. Neuvosto ja yritteliäimmät löysivät suojelua Venäjältä, jossa he liittyivät Ranskasta vallankumouksen jälkeen paenneiden veljiensä ja muiden entisen Puolan suurluostarin jäsenten kanssa Venäjän suurluostariin..