La nuova base dei cavalieri fu creata da un feudo concesso all'Ordine dall'imperatore Carlo V, datato 23 marzo 1530, e comprendeva le isole di Gozo, Comino, Cominotto e Filfla insieme alla città di Tripoli, nel Nord Africa. Due curiose condizioni dell'affitto dei cavalieri erano che l'Ordine dovesse rimanere neutrale in qualsiasi guerra tra nazioni cristiane e che il pagamento annuale dell'affitto consistesse nel versamento di un falco ogni anno a Carlo V: da qui l'origine del termine: Falcone Maltese. I cavalieri, sotto la guida del Gran Maestro Fra. Phillippe de Villiers de l'Isle Adam, ne presero possesso e nei 268 anni successivi crebbero in forza e ricchezza, trasformando Malta in un'isola fiorente. Le difese dell'Ordine sopravvissero a molti attacchi ottomani, tra cui la battaglia di tre mesi del 1565 nota come "Grande Assedio di Malta".

L'Ordine divenne una delle grandi potenze europee grazie alla sua formidabile marina che navigava e proteggeva il Mediterraneo da un nuovo flagello: i pirati barbareschi. Gli ospedali furono tra i primi progetti costruiti a Malta, ma i cavalieri costruirono anche fortezze, torri di guardia e chiese, molte delle quali sono ancora in piedi oggi, quasi 500 anni dopo. L'ospedale principale poteva ospitare 500 pazienti ed era considerato uno dei migliori al mondo. La facoltà di medicina comprendeva anatomia, chirurgia e farmacia. Una specialità particolare era l'oftalmologia. Fu nell'ospedale di Malta che vennero formalmente istituite la specializzazione e la certificazione della pratica medica. La Valletta, la capitale, fu apprezzata come centro di arte e cultura. Fiorirono l'architettura e l'edilizia. Fortificazioni, opere pubbliche, giardini e chiese (tra cui la Chiesa di San Giovanni Battista, completata nel 1577 e dove oggi sono sepolti molti cavalieri) contengono opere di Caravaggio, Mattia Preti e altri.

Il grande assedio di Malta

Il Grande Assedio di Malta del 1565 fu una vittoria straordinaria, con i cavalieri e i loro soldati che riuscirono a sconfiggere le massicce forze nemiche sia per terra che per mare. L'assedio fu uno scontro di inimmaginabile brutalità e una delle battaglie più sanguinose mai combattute. Fu anche un evento che determinò il corso della storia, con la sopravvivenza stessa della cristianità in gioco. Se Malta, di importanza strategica, fosse caduta, l'Impero musulmano ottomano avrebbe presto dominato l'intero Mediterraneo. Anche Roma era in pericolo. Il sultano Solimano controllava la più grande forza combattente del mondo e disponeva di un'armata di 200 navi e di un esercito di 40.000 uomini quando lanciò la sua battaglia contro i cavalieri. Aveva intenzione di cancellare i Cavalieri di San Giovanni e Malta dalla carta geografica. Il 18 maggio, l'artiglieria turca si scatenò seguita da un'ondata dopo l'altra di cavalleria urlante che brandiva la scimitarra. Il Gran Maestro Jean Parisot de la Vallette giurò che il forte non sarebbe stato preso finché un solo cristiano fosse vissuto a Malta. Seicento cavalieri, alcune migliaia di contadini e mercenari locali e qualche migliaio di irregolari maltesi, per un totale di 6.000 e 9.000 uomini, resistettero e alla fine sconfissero una forza nemica molto più grande e schiacciante. Dopo aver ucciso più di 30.000 turchi, gli Ottomani si ritirarono e i cavalieri festeggiarono la vittoria l'8 settembre. L'impresa è diventata parte integrante della storia militare mondiale, in quanto fa parte dell'eroica storia del coraggio e della supremazia militare dei Cavalieri di San Giovanni. Nei tre anni successivi, il Gran Maestro La Vallette progettò e costruì la grande città portuale e fortezza di La Valletta. Morì nel 1568 e non vide mai completato il suo grande progetto. È sepolto nella città che porta il suo nome.

Nel 1775, l'Ordine assorbì l'antico Ordine Ospedaliero di Sant'Antonio di Vienne, i cui possedimenti si trovavano principalmente in Francia. Grazie alla sua accresciuta ricchezza, l'Ordine divenne più visibile e desiderabile per altri, tra cui Napoleone Bonaparte. Nel 1798, dopo aver governato le isole maltesi per più di 250 anni, i cavalieri vennero attaccati dalle forze di Napoleone Bonaparte, diretto alla campagna d'Egitto. Con il tradimento e l'inganno, Napoleone catturò il forte, saccheggiò Malta e sostituì i cavalieri come sovrani dell'isola.

L'allora Gran Maestro - Ferdinand von Hompesch zu Bolheim - se ne andò, con solo pochi cavalieri [1], per Trieste, in Austria (oggi Italia), il 18 giugno 1798, ponendo così fine al coinvolgimento dell'Ordine con l'Isola di Malta in quell'epoca.

I membri meno coraggiosi tornarono nei loro Paesi d'origine, unendosi alle istituzioni indipendenti esistenti o formando nuovi gruppi; sette Cavalieri Professi della Langue d'Italia andarono in Sicilia, sotto la protezione del Papa. Il Consiglio e i più intraprendenti trovarono protezione in Russia, dove si unirono ai loro fratelli fuggiti dalla Francia dopo la Rivoluzione e ad altri dell'ex Gran Priorato di Polonia, nel Gran Priorato di Russia..