De nieuwe basis voor de ridders werd gecreëerd door een leengoed dat aan de orde werd verleend door keizer Karel V, gedateerd 23 maart 1530, en omvatte de eilanden Gozo, Comino, Cominotto en Filfla samen met de stad Tripoli in Noord-Afrika. Twee merkwaardige voorwaarden van de huurovereenkomst van de ridders waren dat de Orde neutraal moest blijven in elke oorlog tussen christelijke naties en dat hun jaarlijkse huurbetaling bestond uit de betaling van één valk per jaar aan Karel V - vandaar de oorsprong van de term: Maltese Valk. De ridders, onder leiding van Grootmeester Fra. Phillippe de Villiers de l'Isle Adam, namen bezit en groeiden in de daaropvolgende 268 jaar in kracht en rijkdom, waardoor Malta veranderde in een bloeiend eiland. De verdediging van de Orde overleefde vele Ottomaanse aanvallen, waaronder de drie maanden durende strijd in 1565 die bekend staat als het "Grote Beleg van Malta".

De Orde werd een van de grootmachten van Europa omdat haar formidabele zeemacht de Middellandse Zee bevoerde en beschermde tegen een nieuwe plaag: de Barbarijse Piraten. Hoewel ziekenhuizen tot de eerste projecten behoorden die op Malta werden gebouwd, bouwden de ridders ook forten, wachttorens en kerken, waarvan er nu, bijna 500 jaar later, nog veel overeind staan. Het hoofdziekenhuis bood plaats aan 500 patiënten en werd beschouwd als een van de beste ter wereld. De medische faculteit bestond uit anatomie, chirurgie en farmacie. Een bijzondere specialiteit was oogheelkunde. Het was in het ziekenhuis van Malta dat specialisatie en certificering van medische praktijken formeel werden vastgelegd. Valletta, de hoofdstad, werd geprezen als een centrum van kunst en cultuur. Architectuur en bouw floreerden. Vestingwerken, openbare werken, tuinen en kerken (waaronder de kerk van St. Johannes de Doper, voltooid in 1577 en waar veel van de ridders nu begraven liggen) bevatten werken van Caravaggio, Mattia Preti en anderen.

Het grote beleg van Malta

Het Grote Beleg van Malta in 1565 was een opmerkelijke overwinning waarbij de ridders en hun soldaten massale vijandelijke troepen te land en ter zee overwonnen. Het beleg was een confrontatie van onvoorstelbare wreedheid en een van de bloedigste veldslagen ooit. Het was ook een gebeurtenis die de loop van de geschiedenis bepaalde, waarbij het voortbestaan van het christendom op het spel stond. Als het strategisch belangrijke Malta zou vallen, zou het islamitische Ottomaanse Rijk al snel het hele Middellandse Zeegebied domineren. Zelfs Rome was in gevaar. Sultan Suleiman controleerde de grootste strijdmacht ter wereld en had een armada van 200 schepen en een leger van 40.000 manschappen toen hij zijn strijd tegen de ridders begon. Hij was van plan om de Johannieter Ridders en Malta van de kaart te vegen. Op 18 mei werd de Turkse artillerie ontketend gevolgd door golf na golf van schreeuwende kromzwaardzwaaiende cavalerie. Grootmeester Jean Parisot de la Vallette zwoer dat het fort niet zou worden ingenomen zolang er één christen op Malta zou leven. Zeshonderd ridders, een paar duizend lokale boeren en huurlingen, en een paar duizend Maltese ongeregeldheden - 6.000 en 9.000 man in totaal - weerstonden en versloegen uiteindelijk een veel grotere, overweldigende vijandelijke macht. Nadat meer dan 30.000 Turken waren gedood, trokken de Ottomanen zich terug en vierden de ridders op 8 september de overwinning. Het wapenfeit is een integraal onderdeel geworden van de militaire wereldgeschiedenis omdat het deel uitmaakt van het heroïsche verhaal van de moed en militaire suprematie van de Johannieter Ridders. In de drie jaar daarna plande en bouwde Grootmeester La Vallette de grote haven- en vestingstad Valletta. Hij stierf in 1568 en zag zijn grote project nooit voltooid worden. Hij ligt begraven in de stad die zijn naam draagt.

In 1775 absorbeerde de Orde de oude Hospitaal Orde van Sint Antonius van Vienne wiens bezittingen voornamelijk in Frankrijk lagen. Door de toegenomen rijkdom werd de Orde zichtbaarder en begeerlijker voor anderen, waaronder Napoleon Bonaparte. In 1798, na meer dan 250 jaar over de Maltese eilanden te hebben geheerst, werden de ridders aangevallen door de troepen van Napoleon Bonaparte die op weg was naar de Egyptische veldtocht. Door middel van verraad en bedrog veroverde Napoleon het fort, plunderde Malta en verdrong de ridders als heersers over het eiland.

De toenmalige Grootmeester - Ferdinand von Hompesch zu Bolheim - vertrok met slechts een paar ridders [1], voor Triëst, in Oostenrijk (nu Italië) op 18 juni 1798, waarmee een einde kwam aan de betrokkenheid van de Orde bij het eiland Malta.

De leden die minder moedig waren, keerden terug naar hun land van herkomst en sloten zich aan bij de bestaande onafhankelijke instellingen of vormden nieuwe groepen; zeven geprofeste ridders van de Langue van Italië gingen naar Sicilië, onder bescherming van de paus. De Raad en de meest ondernemende vonden bescherming in Rusland, waar ze zich bij hun broeders voegden die na de Revolutie uit Frankrijk waren gevlucht en bij anderen van de voormalige Grote Priorij van Polen, in de Grote Priorij van Rusland..